小動(dòng)物活體成像技術(shù)概覽

小動(dòng)物活體成像技術(shù)概覽
1. 背景和原理：
1999年，美國(guó)哈佛大學(xué)Weissleder等人提出了分子影像學(xué)（molecular imaging）的概念——應(yīng)用影像學(xué)方法，對(duì)活體狀態(tài)下的生物過(guò)程進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究。

傳統(tǒng)成像大多依賴于肉眼可見的身體、生理和代謝過(guò)程在**狀態(tài)下的變化，而不是了解**的特異性分子事件。分子成像則是利用特異性分子探針追蹤靶目標(biāo)并成像。這種從非特異性成像到特異性成像的變化，為**生物學(xué)、**早期檢測(cè)、定性、評(píng)估和**帶來(lái)了重大的影響。

分子成像技術(shù)使活體動(dòng)物體內(nèi)成像成為可能，它的出現(xiàn)，歸功于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的使用、新的成像**的運(yùn)用、高特異性的探針、小動(dòng)物成像設(shè)備的發(fā)展等諸多因素。目前，分子成像技術(shù)可用于——研究觀測(cè)特異性細(xì)胞、基因和分子的表達(dá)或互作過(guò)程，同時(shí)檢測(cè)多種分子事件，追蹤靶細(xì)胞，**和基因***優(yōu)化，從分子和細(xì)胞水平對(duì)**療效進(jìn)行成像，從分子病理水平評(píng)估**發(fā)展過(guò)程，對(duì)同一個(gè)動(dòng)物或病人進(jìn)行時(shí)間、環(huán)境、發(fā)展和**影響跟蹤。

分子成像的優(yōu)點(diǎn)：
分子成像和傳統(tǒng)的體外成像或細(xì)胞培養(yǎng)相比有著顯著優(yōu)點(diǎn)。首先，分子成像能夠反映細(xì)胞或基因表達(dá)的空間和時(shí)間分布，從而了解活體動(dòng)物體內(nèi)的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程、特異性基因功能和相互作用。**，由于可以對(duì)同一個(gè)研究個(gè)體進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)跟蹤成像，既可以提高數(shù)據(jù)的可比性，避免個(gè)體差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的可影響，又不需要?dú)⑺滥Ｊ絼?dòng)物，節(jié)省了大筆科研費(fèi)用。第三，尤其在**開發(fā)方面，分子成像更是具有劃時(shí)代的意義。根據(jù)目前的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，由于進(jìn)入臨床研究的**中大部分因?yàn)?*問(wèn)題而終止，導(dǎo)致了在臨床研究中大量的資金浪費(fèi)，而分子成像技術(shù)的問(wèn)世，為解決這一難題提供了廣闊的空間，將使**在臨床前研究中通過(guò)利用分子成像的方法，獲得更詳細(xì)的分子或基因述水平的數(shù)據(jù)，這是用傳統(tǒng)的方法無(wú)法了解的領(lǐng)域，所以分子成像將對(duì)新藥研究的模式帶來(lái)**性變革。其次，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、動(dòng)物基因打靶或制藥研究過(guò)程中，分子成像能對(duì)動(dòng)物的性狀進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，對(duì)表型進(jìn)行直接觀測(cè)和（定量）分析；

2. 分類
分子成像技術(shù)主要分為光學(xué)成像、核素成像、磁共振成像和超聲成像、CT成像五大類。

2－1 光學(xué)成像
活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記。利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。通過(guò)這個(gè)系統(tǒng)，可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性**發(fā)展過(guò)程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程。傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同的時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相比之下，可見光體內(nèi)成像通過(guò)對(duì)同一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動(dòng)及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信。另外, 這一技術(shù)對(duì)腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法, 非常**。因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn), 在剛剛發(fā)展起來(lái)的幾年時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及**開發(fā)等方面。
乳動(dòng)物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)**光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)**光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。對(duì)于**，lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成，帶有這種操縱子的**會(huì)持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。
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基因、細(xì)胞和活體動(dòng)物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。標(biāo)記細(xì)胞的方法基本上是通過(guò)分子生物學(xué)克隆技術(shù), 將熒光素酶的基因插到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，通過(guò)單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選, 培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株。目前, 常用的細(xì)胞株基本上都已標(biāo)記好, 市場(chǎng)上已有銷售。將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)后, 觀測(cè)前需要注射熒光素酶的底物—熒光素，為約280道爾頓的小分子。熒光素脂溶性非常好, 很容易透過(guò)血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個(gè)光子，這是肉眼無(wú)法觀察到的，應(yīng)用一個(gè)高度靈敏的制冷CCD相機(jī)及特別設(shè)計(jì)的成像暗箱和成像軟件，可觀測(cè)并記錄到這些光子。

光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過(guò)組織和皮膚而被檢測(cè)到。利用靈敏的活體成像系統(tǒng)*少可以看到皮下的500個(gè)細(xì)胞，當(dāng)然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的*少細(xì)胞數(shù)是不同的。在相同的深度情況下, 檢測(cè)到的發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系?？梢姽怏w內(nèi)成像技術(shù)的基本原理在于光可以穿透實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織并且可由儀器量化檢測(cè)到的光強(qiáng)度，同時(shí)反映出細(xì)胞的數(shù)量。

熒光發(fā)光是通過(guò)激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)**射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白DsRed 及其它熒光報(bào)告基團(tuán)，標(biāo)記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費(fèi)用低廉和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。同生物發(fā)光在動(dòng)物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性要好得多，近紅外熒光為觀測(cè)生理指標(biāo)的*佳選擇。
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雖然熒光信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來(lái)研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像。但是，熒光成像有其方便，便宜，直觀，標(biāo)記靶點(diǎn)多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點(diǎn)，在一些植物分子生物學(xué)研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對(duì)于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的方法。*近許多文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)中，利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行雙重標(biāo)記，用成熟的熒光成像技術(shù)進(jìn)行體外檢測(cè)，進(jìn)行分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究；然后利用生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)，進(jìn)行活體動(dòng)物體內(nèi)研究。

2－2核素成像
核素成像技術(shù)用于發(fā)現(xiàn)易于為核素標(biāo)記的既定靶目標(biāo)底物的存在，或用于追蹤小量標(biāo)記基因**和進(jìn)行許多**抵抗或病毒載體的傳送。包括微PET、微SPECT。

其中，微PET（正電子發(fā)射斷層掃描儀Positron Emission Tomography）在目前的分子影像學(xué)研究中占據(jù)著極其重要的地位。*先開始的分子影像學(xué)研究就是用PET完成的，如今，用微PET進(jìn)行的單純胞疹病毒胸苷激酶的分子影像學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中。
微PET技術(shù)是將正電子同位素標(biāo)記的化合物注入生物體內(nèi)作為探針，當(dāng)這些化合物參與生物體內(nèi)的代謝過(guò)程時(shí)，PET按照同位素放射性分布的**量進(jìn)行連續(xù)性掃描，根據(jù)動(dòng)力學(xué)原理和圖像數(shù)據(jù)，對(duì)活體組織中的生理生化代謝過(guò)程作出定量分析，如血流量、能量代謝、蛋白質(zhì)合成、脂肪酸代謝、神經(jīng)遞質(zhì)合成速度、受體密度及其與配體結(jié)合的選擇性和動(dòng)力學(xué)等。PET 通常使用的探針是用11C，14N， 15O 及18F 等生物組織中含量*多元素的放射性核素標(biāo)記的化合物，它們具有與體內(nèi)分子類似（包括細(xì)胞代謝）的特點(diǎn)。
在藥理學(xué)研究中，則可以用正電子同位素直接標(biāo)記**，觀察其在活體中的分布和代謝，或測(cè)量生理性刺激及病理學(xué)過(guò)程中**分布與代謝的變化，從而對(duì)**劑量、作用部位、可能發(fā)生的毒副作用等做出前瞻性判斷。還可以判斷其代謝反應(yīng)的類型及產(chǎn)物，觀察**與其他**的相互作用、**與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的相互作用、**與受體的作用、**與酶的相互作用等。

2－3磁共振成像
磁共振（MRI）分子影像學(xué)的優(yōu)勢(shì)在于它的高分辨率（已達(dá)到μm級(jí)），同時(shí)可獲得解剖及生理信息。這些正是核醫(yī)學(xué)、光學(xué)成像的弱點(diǎn)。但是MRI分子影像學(xué)也有其弱點(diǎn)，它的敏感性較低（微克分子水平），與核醫(yī)學(xué)成像技術(shù)的納克分子水平相比，低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。傳統(tǒng)的MRI是以物理、生理特性作為成像對(duì)比的依據(jù)。分子水平的MRI成像是建立在上述傳統(tǒng)成像技術(shù)基礎(chǔ)上，以特殊分子作為成像依據(jù)，其根本宗旨是將非特異性物理成像轉(zhuǎn)為特異性分子成像，因而其評(píng)價(jià)**的指標(biāo)更完善，更具特異性。MRI分子影像學(xué)成像，可在活體完整的微循環(huán)下研究病理機(jī)制，在基因**后表型改變前，評(píng)價(jià)基因**的早期效能，并可提供三維信息，較傳統(tǒng)的組織學(xué)檢查更立體、快速。概括起來(lái)，MRI在分子影像學(xué)的應(yīng)用主要包括基因表達(dá)與基因**成像、分子水平定量評(píng)價(jià)腫瘤血管生成、顯微成像、活體細(xì)胞及分子水平評(píng)價(jià)功能性改變等方面。

2-4超聲成像
此外，超聲分子影像學(xué)是近幾年超聲醫(yī)學(xué)在分子影像學(xué)方面的研究熱點(diǎn)。它是利用超聲微泡造影劑介導(dǎo)來(lái)發(fā)現(xiàn)**早期在細(xì)胞和分子水平的變化，有利于人們更早、更準(zhǔn)確地診斷**。通過(guò)此種方式也可以在患病早期進(jìn)行基因**、****等，以期在根本上****。

2-5CT成像
CT成像是利用組織的密度不同造成對(duì)X射線透過(guò)率的不同而對(duì)人體成像的臨床檢測(cè)技術(shù)。近來(lái)，由于具有更高的分辨率與靈敏度的微CT的出現(xiàn)，使這項(xiàng)傳統(tǒng)的技術(shù)也進(jìn)入分子成像領(lǐng)域。主要是應(yīng)用在腫瘤學(xué)，骨科方面的研究。

3. 成像元素
要使活體中特定的分子成像，熒光成像和核素成像、超聲成像除了要有上述高分辨率、敏感、快速的成像技術(shù)，還要滿足如下幾個(gè)基本條件：
（1）具有高親和力的分子探針。分子探針和經(jīng)典的造影劑的原理類似，它的一端聯(lián)有能夠和生物體內(nèi)特異靶點(diǎn)結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)（如肽類、酶的底物、配體等），另一端是報(bào)告分子（可以是報(bào)告基因，也可以是熒光染料，或者放射性標(biāo)記物），分子探針產(chǎn)生的信號(hào)則由圖像采集系統(tǒng)收集、處理。
（2）分子探針能夠克服各種生理屏障，包括血管壁、細(xì)胞間隙、細(xì)胞膜、血腦屏障等，這是分子成像的一大難點(diǎn)。
（3）生物信號(hào)放大系統(tǒng)。由于分子探針在體內(nèi)的濃度非常低，所以需要通過(guò)化學(xué)或生物的方法使信號(hào)放大。這可以通過(guò)提高靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的濃度等方法實(shí)現(xiàn)。
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值得一提的是，熒光成像技術(shù)由于背景噪音大，特異性差等因素外，熒光探針本身也需要進(jìn)一步改進(jìn)與提高，需要改進(jìn)探針的通透性，提高活性和特異性，降低毒性和副作用等。目前這些改進(jìn)都有專門的公司和機(jī)構(gòu)在研究中。

4．分子成像技術(shù)/設(shè)備性能比較
不同類型的分子成像技術(shù)/設(shè)備有其各自的特點(diǎn)和應(yīng)用領(lǐng)域，研究人員必須詳細(xì)了解這一點(diǎn)，才能選擇購(gòu)買正確的設(shè)備。

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